在我們?nèi)粘Ｉ钪校砻婊钚詣o處不在——從洗碗液、牙膏到化妝品、藥品，甚至農(nóng)業(yè)和環(huán)保領域，都離不開這種能夠降低液體表面張力的物質(zhì)。其中，鼠李糖脂作為一種典型的生物表面活性劑，因其優(yōu)異的表面活性、生態(tài)友好性和生物降解性，已經(jīng)廣泛應用于個人護理、清潔劑、石油回收、農(nóng)業(yè)、食品和藥品等多個行業(yè)。

但鼠李糖脂的產(chǎn)業(yè)化之路始終面臨著一個關鍵瓶頸：其天然主要生產(chǎn)者銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，可能在產(chǎn)品中殘留毒素，這嚴重限制了其在食品、醫(yī)藥和化妝品等安全敏感領域的應用，因此研究人員希望開發(fā)出更加安全的生產(chǎn)平臺，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）因其良好的安全性和代謝能力，成為了理想的替代宿主。

為了天然突破假單胞菌生產(chǎn)能力有限的瓶頸，近日，浙江工業(yè)大學生物技術與生物工程學院柳志強團隊發(fā)表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry的一篇題為“Hyperproduction of Rhamnolipid in?P. putida?by Protein and Metabolic Engineering”的研究中，研究人員通過蛋白質(zhì)工程和代謝工程相結(jié)合改造傳統(tǒng)假單胞菌，最終獲得了大規(guī)模生產(chǎn)鼠李糖脂的工程化菌株 E3，在 5 L 生物反應器中實現(xiàn)了 28.6 g/L 的產(chǎn)量，實現(xiàn)了惡臭假單胞菌中通過代謝工程改造實現(xiàn)的最高產(chǎn)量。

首先，研究人員，采用了理性設計與計算機輔助設計相結(jié)合的策略，對鼠李糖脂合成過程中的關鍵限速酶 RHlA 進行了改造。

圖 | 通過理性設計和計算機輔助設計篩選關鍵限速酶RhlA

利用分子動力學模擬技術，團隊深入分析了 RhlA 與其底物的相互作用模式，通過模擬酶與底物在原子水平上的動態(tài)結(jié)合過程，成功識別出多個對催化功能至關重要的氨基酸殘基。在獲得這些關鍵結(jié)構(gòu)信息的基礎上，研究人員建立了計算機輔助篩選平臺，通過模擬計算預測不同突變位點對酶催化性能的影響。

經(jīng)過多輪篩選，研究人員最終確定了兩個最具潛力的突變位點：F43W 和 G130N。其中，F(xiàn)43W 突變將苯丙氨酸替換為體積更大的色氨酸，這一改變不僅優(yōu)化了底物結(jié)合口袋的空間構(gòu)型，還通過增強疏水相互作用穩(wěn)定了反應中間體。而 G130N 突變則將甘氨酸替換為具有極性側(cè)鏈的天冬酰胺，這一變化在酶活性中心引入了新的氫鍵形成位點，顯著改善了催化反應的環(huán)境。

進一步的分子動力學模擬驗證顯示，這兩個突變協(xié)同作用，使 RhlA 與底物的結(jié)合自由能顯著降低，結(jié)合穩(wěn)定性明顯增強。實驗數(shù)據(jù)證實，經(jīng)過改造的 F43W/G130N 雙突變酶在實際發(fā)酵過程中表現(xiàn)優(yōu)異，與野生型酶相比，鼠李糖脂的產(chǎn)量提升了約 35%，充分證明了該理性設計策略的有效性。

然而，僅僅優(yōu)化關鍵酶的活性還不足以顯著提升鼠李糖脂的生產(chǎn)能力，因此研究團隊進一步進行了代謝工程改造。鼠李糖脂的合成需要兩個關鍵的前體物質(zhì)：dTDP-L-鼠李糖和 β-羥基脂肪酸。

其中，dTDP-L-鼠李糖的合成是限制鼠李糖脂生產(chǎn)的瓶頸之一。為了增加dTDP-L-鼠李糖的供給，研究團隊引入了 rmlBDAC 操作子，這是來自銅綠假單胞菌的一個基因操作子，能夠有效增強 dTDP-L-鼠李糖的合成，此外，通過過表達 rhlA 和 rhlB 基因，研究人員加強了鼠李糖脂合成途徑中的關鍵酶活性。這些代謝工程的手段有效提高了假單胞菌對鼠李糖脂前體的利用效率，使得鼠李糖脂的產(chǎn)量再次提升了約 30%。

圖 | 通過組合啟動子工程與引入前體合成模塊等代謝工程策略，進一步提了高工程菌的鼠李糖脂產(chǎn)量

除了酶工程和代謝工程的優(yōu)化外，研究團隊還通過改造發(fā)酵條件來進一步提升鼠李糖脂的生產(chǎn)效率。發(fā)酵過程中的碳源選擇是影響產(chǎn)量的關鍵因素之一。為了平衡細胞生長與鼠李糖脂的合成，研究團隊采用了葡萄糖和甘油的混合碳源進行發(fā)酵。這種混合碳源的使用不僅能有效支持細胞的生長，還能避免葡萄糖過快消耗導致的生產(chǎn)瓶頸。在此基礎上，研究人員優(yōu)化了發(fā)酵過程中的其他條件，如溫度、pH值和攪拌速率，從而進一步提升了鼠李糖脂的生產(chǎn)效率。

圖 | 工程化的假單胞菌 E3 菌株鼠李糖脂產(chǎn)量達到報道以來最高記錄

通過這些工程化手段，最終研究團隊成功獲得了工程化的假單胞菌 E3 菌株，并在搖瓶發(fā)酵中實現(xiàn)了 5.1 g/L 的鼠李糖脂產(chǎn)量，而在 5 L 的生物反應器中，產(chǎn)量更是達到了 28.6 g/L，生產(chǎn)效率為 0.3 g/L/h，創(chuàng)下了假單胞菌通過代謝工程改造實現(xiàn)的最高產(chǎn)量。

總之，這項研究為我們展示了蛋白質(zhì)工程和代謝工程相結(jié)合的巨大潛力。通過對關鍵酶的工程化改造、代謝途徑的優(yōu)化以及發(fā)酵條件的調(diào)整，研究團隊成功實現(xiàn)了高效的鼠李糖脂生產(chǎn)，通過這一綜合的工程化策略，研究團隊也為未來其他生物合成產(chǎn)品的高效生產(chǎn)提供了寶貴的經(jīng)驗。

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