肌酸（Creatine，CR）是健身愛好者耳熟能詳?shù)难a劑，它不但能提高肌肉的能量儲備，幫助短時間高強度運動恢復，甚至在認知功能和神經保護方面也展現(xiàn)出潛力，隨著應用范圍不斷擴大，全球對肌酸的需求正持續(xù)增長。

然而目前，合成肌酸的傳統(tǒng)的化學合成法存在諸多問題。工業(yè)上常用氰胺和肌氨酸作為原料，這不僅依賴高能耗的化工流程，還會產生氰化物、二氰二胺和二氫三嗪等有毒副產物，帶來環(huán)境與健康風險。因此，尋找綠色、經濟、安全的生產方式成為科研界的重要目標。

近日，江南大學生物工程學院徐美娟團隊在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 發(fā)表了一篇題為“Economical Production of Creatine in Corynebacterium glutamicum via a Multisubstrate Self-Cycling System”的研究成果。他們通過代謝工程手段改造谷氨酸棒狀桿菌，成功構建出一條高效、低成本的肌酸生物合成通路，不僅消除了對昂貴底物的依賴，還實現(xiàn)了生產成本的 92.2% 下降。

谷氨酸棒狀桿菌是一種典型的工業(yè)微生物，早已廣泛應用于氨基酸（如谷氨酸、賴氨酸）的大規(guī)模生產，它的安全性高，被美國 FDA 認定為 GRAS（普遍認為安全）。更重要的是，研究團隊此前已經改造出一株高產 L-精氨酸的工程菌株，可為后續(xù)肌酸合成提供穩(wěn)定而豐富的前體。

在人體內，從精氨酸到肌酸的生成主要分為兩步反應：

AGAT（精氨酸-甘氨酸轉胺酶）：將精氨酸的胍基轉移給甘氨酸，生成胍基乙酸（GAA）；GAMT（胍基乙酸甲基轉移酶）：利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，將 GAA 轉化為肌酸。

研究團隊首先將來源于藍藻的 AGAT 和人源 GAMT 基因導入谷氨酸棒狀桿菌，從而構建了一個完整的合成途徑。

圖 | 在谷氨酸棒狀桿菌中構建的肌酸合成路徑

然而若要實現(xiàn)肌酸在微生物體系中的高效合成，仍需要克服多個代謝瓶頸。

前體 GAA 合成受限。在初始工程菌株中，盡管細胞可積累足量的L-精氨酸，但 AGAT 的催化效率較低，導致 GAA 生成不足。為此，研究人員通過核糖體結合位點（RBS）工程調控 AGAT 的翻譯水平，顯著提升了其可溶性表達和催化能力，結果顯示，GAA 的積累與肌酸產量呈正相關，優(yōu)化后的菌株肌酸水平顯著提高。

圖 | 通過調節(jié) AGAT 基因的表達強度，提高 GAA 合成效率并促進肌酸生成

鳥氨酸反饋抑制。研究人員發(fā)現(xiàn)，在 GAA 生成過程中產生的副產物 L-鳥氨酸會對 AGAT 產生反饋抑制，從而限制代謝通量，因此研究團隊通過重構鳥氨酸循環(huán)，提高了其向L-精氨酸的轉化效率，同時增強了碳酰磷酸合成途徑以保證反應底物供應。

經過改造后，鳥氨酸積累得到消除，從而有效接解除了其對 AGAT 的反饋抑制效應，前體利用效率進一步提高。

SAM 供應不足。GAMT 催化反應一般依賴于 SAM 作為甲基供體，然而，細胞內 SAM 水平常常有限，若外源添加則成本高昂，為此，研究團隊設計了一個 SAM 自供給系統(tǒng)。

首先，研究人員通過引入來自大腸桿菌的高效甲硫氨酸腺苷轉移酶（MetK），顯著提高了 SAM 的合成效率。其次，為避免副產物 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）在細胞內的積累并對甲基轉移反應造成抑制，研究人員導入了來源于酵母的 SAH 水解酶，加速其分解并實現(xiàn)循環(huán)利用。最后，考慮到 SAM 合成對能量需求較高，研究團隊構建了 ATP 再生模塊，通過腺苷激酶與多聚磷酸激酶協(xié)同作用，將腺苷高效轉化為 ATP，為 SAM 持續(xù)合成提供充足能量。

圖 | 通過建立 SAM 自供給與 ATP 再生系統(tǒng)，大幅提升了 SAM 水平，降低外源添加成本

改造后，細胞內 SAM 的水平大幅提高，既避免了對外源添加的依賴，也大大降低了生產成本。

在完成上述多輪優(yōu)化后，研究團隊進一步在基因組中多拷貝整合 gamt 基因，提高了 GAA 向肌酸的轉化效率。

最終，優(yōu)化后的工程菌株表現(xiàn)出了優(yōu)異的生產性能。

優(yōu)化株系在 5 L 生物反應器中實現(xiàn)了 16.8 g/L 的肌酸產量，生產速率為 0.23 g/(L·h)，產率為 0.10 g/g 葡萄糖，均為目前報道的最高水平，更重要的是，整個過程無需外加昂貴的底物 GAA 或 SAM，真正實現(xiàn)了低成本、可持續(xù)的生物制造。

圖 | 放大到 5 L 生物反應器后，肌酸產量達到 16.8 g/L，創(chuàng)下新紀錄

總之，該研究系統(tǒng)性解決了肌酸合成中的前體不足、反饋抑制和 SAM 供體短缺等關鍵問題，建立了一個多底物自循環(huán)的高效合成體系。與傳統(tǒng)化學合成相比，該方法不僅消除了有毒副產物風險，還實現(xiàn)了超過 90% 的成本下降，具有顯著的產業(yè)化潛力。

未來，相信該策略還可拓展應用于其他高附加值營養(yǎng)素和藥物的綠色生產，展示了合成生物學在可持續(xù)生物制造中的廣闊前景。
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