無細胞蛋白質合成（cell-free protein synthesis, CFPS)也被稱為體外蛋白質轉錄翻譯，它是一種以外源mRNA或DNA為模板，在細胞抽提物的酶系中補充底物和能量來體外合成蛋白質。與傳統的體內重組表達系統相比，體外無細胞蛋白合成因其體系靈活開放、便于控制、表達周期短、高耐受性等優點，所以在藥物研究、生物制造和生命科學等領域中得到廣泛的關注與應用。

一、CFPS系統簡介   

CFPS通過提取核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始、延伸和終止因子、核糖體釋放因子等轉錄、翻譯、蛋白質折疊和能量代謝所必需的元素，并向其中添加DNA模板、能量（ATP）和各種輔因子(Mg2+和K+)，模仿胞內環境以合成目標蛋白質。    與傳統活細胞表達系統相比，CFPS系統簡化了基因克隆步驟，無需維持細胞的生長，反應體系簡單，操作簡便，生產周期短，能夠提供一個開放通用的環境，可進行實時的活性監測，可快速取樣，可直接控制蛋白質合成過程。比如，可產生難表達蛋白質（膜蛋白）和細胞毒性蛋白；反應迅速可以高通量篩選蛋白；蛋白合成過程沒有代謝副產物；可實現非天然蛋白質的合成等等。

二、CFPS系統類型    

CFPS系統利用了微生物、植物或動物細胞提取物中的能量和蛋白質合成所必需的成分來生產目的蛋白質。雖然任何生物體都可以提供裂解物，但最常見的CFPS系統主要分為兩種類型：一類是直接來源于細胞裂解物，最常見的細胞提取物來源是大腸桿菌、小麥胚芽、酵母細胞、兔網織紅細胞、CHO細胞和昆蟲細胞等；另一類是純化后的體系，即從大腸桿菌中純化的一系列轉錄和翻譯元件重新組合而成的無細胞轉錄翻譯系統，稱為PURE 體系。使用PURE系統，所有元素都是已知的，可控的，無核酸酶和蛋白酶，并且可以優化每種元素的濃度以實現蛋白質最大化的表達，但成本高，因此目前一般還是采用以粗提物為基礎的CFPS系統。   這些天然細胞本身的特性不同，從它們中得到的提取物必然也是不同的，它們存在各自的優缺點。因此可根據目的蛋白質類型選擇合適的提取物。

三、CFPS系統在生物醫藥的應用   

由于成本、工業放大和蛋白質折疊不再是CFPS系統不可逾越的障礙，因此可以利用無細胞蛋白質合成進行商業化生物醫藥蛋白的生產。國內的康碼生物已建成噸級的體外合成蛋白質生產基地，可見CFPS系統在生物制藥領域，具有十分重要的意義。

1、蛋白類藥物

疫苗：傳統的疫苗存在生產時間長、病毒原料風險大、免疫原性弱、穩定性差等因素的限制，還有一些疫苗在生物體內生產易產生錯誤的糖基化免疫原性蛋白，這可能誘發不正確的免疫應答，這些因素最終制約了疫苗的安全、快速生產和廣泛應用。而CFPS系統可快速生產蛋白質，不受細胞活力的約束，具有高度可優化的開放系統，可用于按需生物制造，是具有前景的疫苗生產工具。例如，Vaxcyte公司通過現代無細胞蛋白質合成平臺重新設計高度復雜的疫苗制造方式，Vaxcyte目前正在開發多款細菌疫苗產品，其中24和31價肺炎球菌結合疫苗即將進入3期臨床，在研的新型疫苗還有VAX-PG，VAX-GI和VAX-A1等。

抗體：目前抗體藥物主要包括單抗，雙抗，ADC和多特異性抗體治療藥物，現階段生產抗體主要是基因重組的方式大規模生產的，即主要通過哺乳動物細胞系進行生產，但是體內表達的生長周期限制了下一步篩選的速率，下游的純化過程也有一定的難度，并且一些復雜抗體很難合成。因此，抗體的合成需要一個更快捷的生產體系，而CFPS憑借其反應迅速、純化簡單并且真核無細胞體系能夠滿足復雜抗體的后修飾需求，所以將成為合成抗體的新興體系。例如，Sutro Biopharma公司專注于利用無細胞蛋白合成平臺開發ADC和多特異性抗體療法,其中STRO-001產品，針對CD74的ADC，其適應癥為多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤；以及STRO-002，針對葉酸受體-α的ADC，用于治療卵巢和子宮內膜癌。目前這兩款藥物都處在1期臨床。（值得提醒：Vaxcyte公司分拆自美國生物制藥公司Sutro Biopharma，無細胞蛋白合成平臺由Sutro Biopharma獨家授權）

2、翻譯后修飾藥物

翻譯后修飾 (Post-translational modification，PTM) 指蛋白質在翻譯后的化學修飾，可以極大影響蛋白質的折疊、活性和穩定性等方面，在生物體中發揮著重要作用，很多醫藥蛋白都具有不同形式的后修飾，這在異源宿主中通常是很難表達的。相比之下，CFPS系統允許其組分靈活加減，為蛋白質折疊和精準化修飾提供了可控環境。目前已發現幾百多種不同的官能團修飾類型，常見的PTM形式有糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等，本文著重介紹糖基化和磷酸化這兩大主要的翻譯后修飾類型。   

蛋白質糖基化修飾是主要的PTM類型之一，發生在50%真核蛋白質上，大多數FDA批準的生物醫藥上都有糖基化修飾，對重組蛋白質藥物的生產尤為重要，因為糖基化不當，會對藥物的活性、穩定性、免疫原性和半衰期產生不利。目前由于細胞代謝的復雜性和干擾，在細胞中構建和測試來確定蛋白質糖基化修飾仍然具有挑戰性。例如，Yadavalli R等研究一種糖基化瘧疾蛋白，之前使用原核和真核細胞表達的瘧疾蛋白糖基化不佳，可溶性差，折疊不當，導致免疫原性降低。而嘗試基于HeLa細胞的CFPS卻可以體外合成了糖基化的瘧疾蛋白。   

蛋白質磷酸化修飾是第二大類蛋白質后修飾，磷酸化是磷酸基團與蛋白質的可逆結合，然而由于技術限制，無法以高純度和高產量生產具有特定磷酸化狀態的磷酸化蛋白，Oza等通過原核CFPS體外合成了高活性的雙磷酸化人MEK1激酶，首次證明了使用CFPS平臺可以顯著提高磷酸化蛋白合成的產量和產率。

3、非天然蛋白藥物   

非天然氨基酸 (Unnatural amino acids, UNAAs)嵌入是利用含有特殊側鏈的非天然氨基酸取代天然氨基酸，用來改善多種具有新的理化性質和生物學功能的蛋白質。由于天然氨基酸側鏈功能基團的有限性，單靠20種標準氨基酸已不能滿足科研日益增長的需求 ，迄今已有超過150種非天然氨基酸可以引入生物體內，其中大多數非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物，因此作為一個強大的合成生物學工具，在非天然生物蛋白藥物領域引起了極大的關注。   

非天然氨基酸嵌入主要有兩種方法：一種是全局抑制，利用天然翻譯機器將非天然氨基酸嵌入蛋白質; 另一種是最常用的琥珀抑制，利用琥珀終止密碼子，依賴于正交翻譯系統的突變氨酰tRNA合成酶和tRNA配對，將非天然氨基酸嵌入蛋白質。但是這些方法都需要維持細胞的生長狀態，其過程繁瑣導致產量低，且一些UNAA不易穿過細胞膜，還會對細胞產生毒性，抑制細胞生長，這些都限制了UNAA的嵌入效率。而CFPS沒有細胞膜的屏障，能夠提高UNAA的利用率和保真度，目前CFPS系統已成功應用于這兩種方法，并且非常容易地通過優化非天然氨基酸的濃度以避免非天然氨基酸嵌入的低效率瓶頸，因此生物醫藥領域越來越多的使用CFPS體系進行非天然蛋白質的合成。例如，Sutro Biopharma公司在ADC藥物的開發中，利用CFPS平臺為抗體和抗癌藥物之間的穩定連接提供了更有效的UNAA嵌入和偶聯方法。   

除此之外，CFPS系統已在基因電路設計、膜蛋白、病毒樣顆粒、多肽、蛋白質進化，還有“人工生命”構建包括噬菌體合成和人工細胞構造等研究中展現出巨大的應用潛力。

一、挑戰與展望   

盡管CFPS比活細胞系統具有諸多優勢，然而無細胞蛋白質合成系統的發展中，仍然面臨諸多挑戰。其中最大障礙是工業規模化和成本，一些難合成的蛋白質生產離不開動物和昆蟲細胞的提取物，然而制備過程繁瑣，耗時較長，是擴大工業化生產有待解決的一大問題；此外還有昂貴試劑成本的限制。   

在未來的發展中，無細胞體系需要進一步優化以提高效率、降低成本、提高系統的穩定性，實現更好的蛋白質翻譯后修飾，同時提高蛋白合成的個性化、多樣化和普適性。此外隨著AI技術的快速發展，AI可以賦能無細胞蛋白合成，其AI可以利用算法分析數據，預測蛋白質表達的最佳參數，實現高通量表達并改善合成效率。例如，Tierra Biosciences公司通過將自動化技術和AI學習平臺實現了無細胞蛋白質合成的高效快速生產，這種技術的突破不僅大幅提高了生產效率，還降低了成本，使得大規模生產成為可能。盡管CFPS還面臨很多挑戰，但是人們通過不斷的探索和研究，有望繼續創新和發展，相信不遠的將來，CFPS系統將會成為蛋白質合成的通用平臺，即將迎來生物醫藥新時代。

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北京鴻潤寶順科技有限公司創建于2008年，位于北京自由貿易試驗區科技創新片區，是一家以蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、等微生物培養基原材料和發酵原料為主，集研發、生產、銷售為一體的現代化高新技術企業。2020年在四川省閬中市建立生產基地。產品供應國內外所有生物醫藥產區，為行業企業提供大量生物發酵所需的有機氮源原料，不斷創新技術、調整配方、升級工藝，用更好的產品助力行業發展。

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