紫蘇醇是一種具有廣泛抗癌活性的單萜類(lèi)化合物，目前主要依賴(lài)于植物提取和化學(xué)合成，但這些方法存在產(chǎn)量低、成本高以及環(huán)境污染等問(wèn)題。近年來(lái)，隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物合成紫蘇醇及其前體化合物檸檬烯成為一種更具可持續(xù)性和工業(yè)可行性的替代方案。

          2025年4月25日，來(lái)自江南大學(xué)生物工程學(xué)院、工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的白仲虎教授與劉春立副研究員在《ACS Synthetic Biology》雜志發(fā)表了題為“Engineering Escherichia coli for Perillyl Alcohol Production with Reduced Endogenous Dehydrogenation”的研究論文，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)代謝工程改造大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖直接合成檸檬烯和紫蘇醇，為高效生產(chǎn)這種重要化合物提供了新的思路。研究人員首先采用系統(tǒng)工程方法，優(yōu)化了大腸桿菌中的甲羥戊酸（MVA）途徑，以提高檸檬烯的合成效率。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)篩選不同來(lái)源的檸檬烯合成酶，發(fā)現(xiàn)來(lái)自檸檬（Citrus limon）的合成酶表現(xiàn)最佳，能夠產(chǎn)生52.23 mg/L的檸檬烯。進(jìn)一步通過(guò)截短檸檬烯合成酶的N端信號(hào)肽、優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）和調(diào)整基因表達(dá)強(qiáng)度等策略，檸檬烯產(chǎn)量顯著提升至417.04 mg/L。在紫蘇醇合成方面，團(tuán)隊(duì)引入了來(lái)自Mycobacterium sp. HXN-1500的細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)，并敲除了大腸桿菌內(nèi)源的乙醇脫氫酶基因yqhD，以減少副產(chǎn)物的生成。最終，通過(guò)兩相發(fā)酵技術(shù)，紫蘇醇的產(chǎn)量達(dá)到了309.1 mg/L，這是目前搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)中報(bào)道的最高水平。

圖1. 從葡萄糖到檸檬烯和紫蘇醇的生物合成路徑

研究團(tuán)隊(duì)利用葡萄糖作為起始原料，通過(guò)引入甲羥戊酸（MVA）途徑和檸檬烯合成酶（Ls），成功在大腸桿菌構(gòu)建了從葡萄糖到檸檬烯的合成路徑。檸檬烯合成酶是這一過(guò)程中的關(guān)鍵酶，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)篩選不同來(lái)源的檸檬烯合成酶，發(fā)現(xiàn)來(lái)自檸檬（Citrus limon）的合成酶在大腸桿菌中表現(xiàn)出最高的檸檬烯產(chǎn)量，達(dá)到52.23 mg/L，而來(lái)自薄荷（Mentha spicata）的合成酶產(chǎn)量為26.27 mg/L，來(lái)自黃果冷杉（Abies grandis）的合成酶則未能檢測(cè)到檸檬烯的產(chǎn)生。

圖2. 不同來(lái)源的檸檬烯合成酶以及MVA途徑對(duì)檸檬烯產(chǎn)量的影響

隨后，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將GPP合成酶替換為NPP合成酶，進(jìn)一步優(yōu)化了合成路徑，使檸檬烯的產(chǎn)量提高到75.68 mg/L，較之前增加了1.4倍。此外，通過(guò)調(diào)整MVA途徑中基因的拷貝數(shù)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)將某些基因從低拷貝數(shù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到高拷貝數(shù)質(zhì)粒可以顯著提高檸檬烯的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明，通過(guò)代謝工程手段優(yōu)化合成路徑中的關(guān)鍵酶和基因表達(dá)水平，可以顯著提高檸檬烯的合成效率。

圖3. 不同截短位置對(duì)檸檬烯合成酶（Cl(Ls)）的影響

 研究人員通過(guò)截短檸檬烯合成酶（Ls）的N端信號(hào)肽來(lái)優(yōu)化其在大腸桿菌中的表達(dá)和活性。基于預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，設(shè)計(jì)了6種不同截短位置的Ls突變體，以增強(qiáng)其在大腸桿菌中的異源表達(dá)效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，截短至第7個(gè)氨基酸的Ls突變體（Lim-3）表現(xiàn)出最高的檸檬烯產(chǎn)量，達(dá)到139.91 mg/L，相比未截短的野生型酶提高了1.8倍。進(jìn)一步截短則導(dǎo)致產(chǎn)量顯著下降，例如截短至第12、17、31和52個(gè)氨基酸的突變體，其檸檬烯產(chǎn)量分別降至50.97 mg/L、15.14 mg/L、4.62 mg/L和幾乎無(wú)法檢測(cè)到的水平。這表明，適度截短N(yùn)端信號(hào)肽可以顯著提升Ls的催化效率，但過(guò)度截短則會(huì)破壞其功能，因此優(yōu)化截短策略對(duì)于提高檸檬烯產(chǎn)量至關(guān)重要。

圖4. 篩選合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）以提高檸檬烯產(chǎn)量   

研究人員通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）工程和蛋白質(zhì)融合策略進(jìn)一步優(yōu)化檸檬烯合成路徑。首先，利用RBS計(jì)算器設(shè)計(jì)了不同翻譯效率的RBS序列，并將其應(yīng)用于NPP合成酶和Ls合成酶的表達(dá)優(yōu)化。通過(guò)篩選19種不同的RBS組合，發(fā)現(xiàn)R3組合（NPP的RBS值為75,440，Ls的RBS值為135,307）表現(xiàn)出最高的檸檬烯產(chǎn)量，達(dá)到206.56 mg/L，相比之前的Lim-3菌株提高了1.47倍。此外，研究團(tuán)隊(duì)還嘗試通過(guò)蛋白質(zhì)融合策略將NPP和Ls更緊密地結(jié)合在一起，以提高底物利用效率，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合蛋白工程化的菌株（L1-L4）的檸檬烯產(chǎn)量略低于RBS優(yōu)化的菌株。這表明，在本研究中，RBS工程比蛋白質(zhì)融合策略更為有效。

  圖5. 通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)和啟動(dòng)子工程優(yōu)化檸檬烯合成路徑      

進(jìn)一步，研究人員通過(guò)模塊化策略?xún)?yōu)化大腸桿菌中檸檬烯合成路徑。通過(guò)將檸檬烯合成路徑劃分為三個(gè)模塊：上游模塊（mvaE和mvaS）、中游模塊（mvK、pmK、mvaD和idi）以及下游模塊（NPP和Ls）。通過(guò)調(diào)整各模塊的表達(dá)強(qiáng)度和基因位置，研究團(tuán)隊(duì)逐步優(yōu)化了整個(gè)代謝路徑。首先，將Ls基因從單T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移到NPP下游，形成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，減少了表達(dá)載體上的基因表達(dá)盒數(shù)量，使檸檬烯產(chǎn)量達(dá)到248.85 mg/L。進(jìn)一步將Idi基因轉(zhuǎn)移到中游模塊，使產(chǎn)量提高到300.85 mg/L。然而，當(dāng)改變下游模塊的表達(dá)載體拷貝數(shù)時(shí)，產(chǎn)量意外下降，表明過(guò)高的下游通量可能抑制了檸檬烯的積累。最終，通過(guò)在Ls的N端添加Cm29融合標(biāo)簽，進(jìn)一步提高了檸檬烯產(chǎn)量至417.04 mg/L。這一結(jié)果表明，通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)和精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)，可以有效提高檸檬烯的合成效率，為后續(xù)紫蘇醇的合成提供了更高的前體供應(yīng)。

圖6. yqhD基因在紫蘇醇生物轉(zhuǎn)化中的作用及其對(duì)紫蘇醛生成的影響

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中乙醇脫氫酶（yqhD）基因的過(guò)表達(dá)會(huì)增加紫蘇醇被氧化為紫蘇醛的速率，而敲除yqhD基因則顯著減少了紫蘇醛的生成。實(shí)驗(yàn)中，野生型大腸桿菌在處理100 mg/L紫蘇醇時(shí)產(chǎn)生了7.52 mg/L的紫蘇醛，而yqhD敲除菌株僅產(chǎn)生3.89 mg/L紫蘇醛，降低了52.91%。相反，yqhD過(guò)表達(dá)菌株的紫蘇醛產(chǎn)量增加到10.19 mg/L。通過(guò)體外酶活性測(cè)定，研究團(tuán)隊(duì)確定了YqhD催化紫蘇醇轉(zhuǎn)化為紫蘇醛的最佳條件：pH 9.0和溫度30°C。在此條件下，YqhD的催化效率較高，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明對(duì)紫蘇醇具有較強(qiáng)的親和力（Km = 1.26 mM）和較高的催化效率（kcat/Km = 16.22 min?1·mM?1）。這些結(jié)果表明，yqhD在紫蘇醇的氧化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)敲除yqhD基因可以有效減少副產(chǎn)物紫蘇醛的生成，從而提高紫蘇醇的產(chǎn)量。

圖7. 優(yōu)化后的代謝途徑在搖瓶發(fā)酵中紫蘇醇的產(chǎn)量 

最后，研究團(tuán)隊(duì)將細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)（Cyp450）整合到大腸桿菌中，并通過(guò)敲除yqhD基因減少了紫蘇醛的生成，從而提高了紫蘇醇的產(chǎn)量。研究中，yqhD敲除菌株（POH-2）在搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)生了52.37 mg/L的紫蘇醇，相比野生型菌株（POH-1）提高了31.35%。進(jìn)一步增加電子傳遞蛋白Fdx的表達(dá)，使紫蘇醇產(chǎn)量提升至117.58 mg/L。在優(yōu)化發(fā)酵條件后，通過(guò)添加10%的DINP（鄰苯二甲酸二異壬酯）作為覆蓋層，紫蘇醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高至173.6 mg/L。此外，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，調(diào)整葡萄糖濃度對(duì)紫蘇醇產(chǎn)量有顯著影響。在15 g/L葡萄糖條件下，紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到最高值309.1 mg/L，這是目前搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)中報(bào)道的最高水平，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。    

總之，這項(xiàng)工作不僅成功構(gòu)建了一種高效合成紫蘇醇的大腸桿菌細(xì)胞工廠(chǎng)，還揭示了減少副產(chǎn)物形成對(duì)于提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的關(guān)鍵作用。通過(guò)代謝工程手段，研究團(tuán)隊(duì)不僅優(yōu)化了檸檬烯的合成途徑，還通過(guò)敲除關(guān)鍵基因和增強(qiáng)電子傳遞效率，顯著提高了紫蘇醇的合成效率。這一成果不僅為紫蘇醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也為其他萜類(lèi)化合物的微生物合成提供了重要的參考。未來(lái)，隨著更多代謝工程策略的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，有望進(jìn)一步提高紫蘇醇的產(chǎn)量，推動(dòng)其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為可持續(xù)生物制造和綠色化學(xué)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

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